Проблема образования сгустков при проведении клеточных исследований с обогащенной тромбоцитами плазмой и пути ее решения

Введение. Формирование сгустков в культуральной среде при добавлении обогащенной тромбоцитами плазмы (platelet-rich plasma, PRP) значительно усложняет изучение функциональных свойств клеток. Необходимость эффективного решения данной проблемы обусловлена ее влиянием на оценку жизнеспособности и метаболизма клеток, что ставит под угрозу валидность результатов экспериментов. Цель исследования: исследовать влияние различных препаратов на образование сгустков в PRP и оценить их воздействие на жизнеспособность и метаболизм человеческих кожных фибробластов (ФКЧ). Материалы и методы. Для исследования были использованы образцы крови 5 добровольцев-доноров, средний возраст 20 [19; 21] лет. Использовалась стандартная процедура получения PRP, включающая двукратное центрифугирование. Проведены 2 этапа активации PRP: разморозка с последующим добавлением одного из препаратов и добавление хлорида кальция. Перед активацией и внесением в культуральную среду в каждую пробу добавляли различные химические соединения для предотвращения образования сгустков: ингибитор полимеризации фибрин-мономера (ИПФМ), гепарин, декстрана сульфат в разных концентрациях. Жизнеспособность клеток линии hTERT-HDFa (линия иммортализованных фибробластов кожи человека) определяли методом МТТ (колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток) и тестом с резазурином. Результаты. Наибольшей эффективностью обладает гепарин в концентрации 25 ME/мл и ИПФМ в концентрации 1,0 мг/мл. Они предотвратили образование сгустков и улучшили показатели жизнеспособности и метаболизма клеток по сравнению с контрольной группой. Заключение. Наиболее эффективным средством предотвращения образования сгустков являются гепарин и ИПФМ. Полученные результаты требуют дополнительного подтверждения и дальнейших исследований для выявления механизмов улучшения жизнеспособности клеток при их использовании. Introduction. Clot formation in a culture medium with added platelet-rich plasma (PRP) significantly complicates the study of the functional cell properties. The need for an effective solution to this issue is attributed to its impact on the assessment of cell viability and metabolism, which jeopardizes the validity of the experimental results. Aim: to study the effect of various agents on clot formation in PRP and to evaluate their impact on the viability and metabolism of human skin fibroblasts (HSF). Materials and Methods. Blood samples from five volunteer donors (median age 20 [19; 21] years) were used for the study. The standard procedure of double centrifugation was utilized for preparing PRP. Two steps of PRP activation were performed: thawing followed by the addition of an agent and calcium chloride. Before activation and addition to the culture medium, various chemical substances were added to each sample to prevent clot formation: fibrin monomer polymerization inhibitor (FMPI), heparin, and dextran sulfate in different concentrations. The viability of the hTERT-HDFa cells (immortalized human skin fibroblast cells) was determined by the MTT assay (colorimetric assay for assessing cell metabolic activity) and the Alamar Blue assay. Results. The data obtained showed that heparin at a concentration of 25 IU/ml and FMPI at a concentration of 1 mg/ml are the most effective in preventing clot formation and improving cell viability and metabolism compared to the control group. Conclusion. The most effective agents for preventing clot formation are heparin and FMPI. The obtained results require additional confirmation and further studies to identify the mechanisms of improving cell viability when using them.