不同胶原酶对慢性移植物抗宿主病小鼠唾液腺免疫细胞分析的影响

目的 初步探讨不同胶原酶对慢性移植物抗宿主病（cGVHD）小鼠唾液腺免疫细胞分析的影响。 方法 构建主要组织相容性复合体不相合小鼠模型（骨髓：5×106个细胞；脾：0.25×106个细胞），包括无GVHD组（BALB/c小鼠供BALB/c小鼠，15只）和cGVHD组（C57BL/6小鼠供BALB/c小鼠，15只），移植后观察小鼠体重、症状评分和生存率。在移植后第45天，收集各组小鼠的唾液腺（6～12只），进行HE和Masson三色染色评估损伤及纤维化程度；通过流式细胞术分析，比较无胶原酶消化、Ⅱ型胶原酶消化和D型胶原酶消化对免疫细胞表型的影响。 结果 与无GVHD组相比，cGVHD组小鼠移植后体重下降［移植后第60天初始体重占比:（66.77±11.72）％对（101.20±4.19）％，P<0.0001］，症状评分高（2.11±0.59对0±0，P<0.0001），存活率降低［移植后第60天存活率：50％对100％，P＝0.0011］。cGVHD小鼠唾液腺表现为腺泡结构萎缩，细胞浸润（病理评分：3.67±0.52对2.00±0，P<0.0001）和明显纤维化［胶原纤维面积占比：（14.54±4.05）％对（4.11±0.87）％，P＝0.0001］。使用胶原酶消化的方法显著增加了单个核细胞的总数和活率（P值均<0.05），其中含Ⅱ型胶原酶方案获得的单个核细胞数量最高（P<0.01）。但是Ⅱ型胶原酶消化降低了CD4+ T细胞比例［（5.64±2.05）％对（31.98±12.23）％，P＝0.0052］，而D型胶原酶对CD4+ T细胞无明显影响［（31.51±16.37）％对（31.98±12.23）％，P＝0.9973］。cGVHD组中，含D型胶原酶方案能够获得更多CD4+ T细胞而含Ⅱ型胶原酶方案能够获得更多CD8+T细胞（P值均<0.05）。NK细胞数量在两种胶原酶处理下均显著增加（P值均<0.05）。在髓系细胞中，Ⅱ型胶原酶降低Ly6ClowCD11b+Ly6G+中性粒细胞比例［（0.05±0.01）％对（0.34±0.20）％，P＝0.0171］，D型胶原酶无影响［（0.49±0.19）％对（0.34±0.20）％，P＝0.2800］。在cGVHD组中，D型胶原酶处理后获得的CD11b+Ly6C+Ly6G-单核细胞数量高于Ⅱ型胶原酶［（0.06±0.05）×105对（0.01±0）×105，P＝0.0384］，而Ⅱ型胶原酶处理后获得的巨噬细胞数量明显高于D型胶原酶［（1.42±0.56）×105对（0.57±0.36）×105，P<0.0001］。 结论 使用胶原酶消化显著增加了单个核细胞的数量和活率。其中含Ⅱ型胶原酶方案对分离CD8+ T细胞、NK细胞和巨噬细胞最优；D型胶原酶则更有效地富集CD4+T细胞、中性粒细胞与单核细胞。