Rolle der Calciumkonzentration im Zellkulturmedium RPMI für Ausmaß und Kinetik der Glucose-stimulierten Insulinsekretion

Hintergrund und Ziel Der Isolierung von Pankreasinseln mittels Kollagenaseverdau wird derzeit routinemäßig eine Zellkulturphase nachgeschaltet, die erst reproduzierbare und relevante Ergebnisse ermöglichen soll („recovery“). Es ließen sich jedoch reproduzierbare Unterschiede in der Glucose-stimulierten Insulinsekretion zwischen frisch isolierten und kultivierten Inseln zeigen. Überraschender Weise zeigte sich, dass eine kurzfristige Kulturphase (3 h) im Gegensatz zur Übernachtkultur (22 h) zu einer starken Verminderung der Glucose-stimulierten Insulinsekretion führte. Die diesen Phänomenen zugrunde liegenden Mechanismen sollen in diesem Projekt weiter aufgeklärt werden. Methode NMRI-Mausinseln wurden durch Kollagenase-Injektion in den Gallengang isoliert und frisch oder nach Kultur in RPMI+10% FBS (5 mM Glucose) verwendet. Die Insulinsekretion wurde durch Umströmung mit Krebs-Ringer Medium (KR-Medium) und ELISA des fraktionierten Eluats gemessen. Die NAD(P)H- und FAD-Autofluoreszenz wurde als Parameter des Angebots an reduzierenden Äquivalenten bestimmt, die TMRE-Fluoreszenz als Indikator des mitochondrialen Membranpotentials. Der ATP-/ADP-Gehalt wurde nach statischer Inkubation und Extraktion der Adeninnukleotide mittels der Luciferasereaktion erfasst. Ergebnisse Der Stimulus war eine maximal wirksame Glucosekonzentration (30 mM) nach einer 60-minütigen Perifusion ohne Glucose. Nach 10-minütiger Latenz zeigten frisch isolierte Inseln eine über 40 min kontinuierlich ansteigende Insulinsekretion, die mit Auswaschen der Glucose vollständig reversibel war. 3 h kultivierte Inseln zeigten keine Reaktion auf den Glucosestimulus, erst mit Auswaschen war ein geringer Anstieg der Sekretion erkennbar. 22 h kultivierte Inseln zeigten dagegen einen schnell einsetzenden steilen Sekretionsanstieg, der nach 10 min in ein nur mäßig erhöhtes Plateau überging. Sowohl in frisch isolierten wie auch in kultivierten Inseln führte 30 mM Glucose zu einem Anstieg reduzierender Äquivalente. Dabei war der Anstieg der ATP-/ADP-Ratio und der des mitochondrialen Membranpotentials in 3 h kultivierten Inseln sogar signifikant höher als in frischen Inseln. Der Unterschied in der Sekretionsleistung war auch vorhanden, wenn Inseln verglichen wurden, die zuvor für 3 h mit KR-Medium oder mit RPMI+FBS umströmt worden waren. Wurde jedoch die freie Ca2+-Konzentration im RPMI auf den gleichen Wert wie im KR-Medium eingestellt, so zeigten diese Inseln ein schnelles und deutliches Ansprechen auf den Glucosestimulus. Schlussfolgerung Pankreasinseln, die kurzfristig mit dem für Inselkultur typischen RPMI-Medium in Kontakt standen (statisch oder umströmt), zeigten eine stark verminderte Sekretionsleistung verglichen mit KR-Medium-exponierten Inseln. Dieser Unterschied war nicht auf verminderten mitochondrialen Metabolismus zurückzuführen. Die verglichen mit dem KR-Medium geringere Ca2+Konzentration des RPMI scheint maßgeblich verantwortlich zu sein. Publication History Article published online: 04 May 2026 © 2026. Thieme. All rights reserved. Georg Thieme Verlag KG Oswald-Hesse-Straße 50, 70469 Stuttgart, Germany